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重金属离子对烤烟叶片中铜锌超氧化物歧化酶活性的影响_邓家军

发布时间:

邓家军等

重金属离 子对烤烟叶片中铜锌超氧化物歧化酶活性的影响

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烟气与化学

重金属离子对烤烟叶片中铜锌超氧化物 歧化酶活性的影响
邓家军
1, 2

, 胡继伟 , 李继新 , 苏贤坤 , 黄先飞 , 刘

1

3

3

1



1

1 贵州师范大学贵州省山地环境信息系 统与生态环境保护重点实验室 , 贵阳市宝山北路 116 号 550001; 2 贵州师范大学生命科学学院 , 贵阳市宝山北路 116 号 , 50001; 3 贵州省烟草科学研究所 , 贵阳市威清路 334 号 , 550003



要 : 为研究重金属对烟叶铜锌超氧化物 歧化酶的作用规律 , 消除活体烟叶中 其它因素的 影响 , 本试验采用 离体方法 , 利用硫 酸

铵盐析分级 分离、 乙醇 - 氯仿 沉淀 除杂、 丙 酮再 沉淀 分级 得到 只含 铜锌 超氧 化物 歧化 酶的 酶液。 研究 了 不同 浓度 的 Fe2+ 、 Mn2+ 、 Se2+ 、 Sb2+ 、 Cd2+ 对该酶的影响。结果显示 : 在浓度为 0~ 100 mg/ L 范围内 , Fe2+ 、 Mn2+ 、 Sb2+ 、 Cd2+ 都能使铜 锌超氧化 物歧化酶的 活 性先降低后升高 , 但在相同浓度下 , Cd2+ 对酶活性的影响最 大 , 其 次是 Mn 2+ 、 Fe2+ 。 Sb2+ 使该酶的活 性的变化 趋势与 Cd 2+ 、 Mn2+ 基 本一致 , 仅变化幅度不及 Cd2+ 、 Mn 2+ 显著。 Se2+ 能降低该酶的活性 , 当浓 度为 10 mg/ L 时 , 酶 活性的降 低率为 58 78 % 。当 Se2+ 浓 度为 20 mg/ L 时 , 酶活性几乎完全丧失。分析了铜锌超氧化物歧化酶活性受 Fe2+ 、 Mn 2+ 等影响的可能机制 , 以期为烟草重金属污 染 的酶学指标监测系统的建立提供数据支持。 关键词 : 烤烟 ; 超氧化物歧化酶 ; 活性 ; 重金属离子 ; 影响 doi: 10 3969/ j. issn. 1004 - 5708 2010 03 001 中图分类号 : TS411. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1004 - 5708( 2010) 03 - 0001 - 06

Effects of heavy metal ions on copper zinc superoxide dismutase activity in flue -cured tobacco leaves
DENG Jia - Jun1, 2 , HU Ji wei1, LI Ji xin 3, SU Xian - kun3, HUANG Xian -fei1 , LIU Feng1 1 Guizhou Provincial Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment , Guizhou Normal University, No. 116, Baoshan North Road, Guiyang 550001, China; 2 School of Life Sciences, Guizhou Normal University, No. 116, Baoshan North Road, Guiyang 550001, China; 3 Guizhou Provincial Institute of Tobacco Science, No. 334, Weiqing Road, Guiyang 550003, China Abstract : In vitro method was applied to study the changing trends in the copper - zinc superoxide dismutase activity caused by heavy metals in order to eliminate influence ofvarious environmental factors. Enzyme solution of copper - zinc superoxide dismu tase from tobacco leaves was obtained by using ammonium sulphate to form different levels of precipitates and isolated by using chloroform and alcohol and further cleaned - up with acetone. The effects of Fe , Mn
2+ 2+

, Se , Sb

2+

2+

, and Cd

2+

with differ -

ent concentrations on copper - zinc superoxide dismutase were studied, and results showed that the activity of copper - zinc super oxide dismutase incresed at first and then decreased in response to increasing Fe2+ , Mn2+ , Sb2+ , or Cd2+ supply from 0 to
作者简介 : 邓家军 , 男 , 硕士研究生, 主要从事植物化学和环境化学研究 , E -mail : dengjj2118@ 163 com 胡继伟 ( 通讯作者 ) , 男 , 博士 , 教授 , 主要从事环境化学和资源化学研究 , Tel: 0851 -6700996, E -mail : jiweihu@ yahoo. com 基金项目 : 教育部科学技术研究重点项目 ( 206135) , 贵州省高级人才特助经费 ( TZJF -2006 -27) , 贵州省教育厅自然科学研究重点项目 ( 2005106) 收稿日期 : 2009 -05 - 12

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中国烟草学报

2010 年 6 月 第 16 卷 第 3 期

100 mg/ L. At the same concentration, however, Cd2+ exhibited the strongest influence on the change of copper - zinc superox ide dismutase activity, followed by Mn 2+ and Fe2+ . The change of the enzyme activity under the effect of Sb2+ was similar to, but not more than, that of Cd
2+

or Mn

2+

. While Se

2+

can reduce the activity of copper - zinc superoxide dismutase, the de -

creasing rate of the enzyme act ivity was 58. 78 % in response to the increasing Se 2+ supply of 10 mg/ L. When the concentra tion of Se2+ reached 20 mg/ L, the enzyme activity was almost ent irely lost . Copper - zinc superoxide dismutase activities under the effects of heavy metal ions Fe , Mn
2+ 2+

, Se , Sb

2+

2+

, and Cd

2+

can be ascribable to the result that the three main factors

interacted. This research may provide useful data for the establishment of zymological indicator systems, which can monitor the potential heavy metal contamination risk during different tobacco growth stages. Key words: flue - cured tobacco; superoxide dismutase; heavy metals ions 烟草 ( Nicotiana Tabacum L. ) , 茄科, 烟 草属, 为一 年生或多年生植物。是我国重要的经济作物之一
[ 1]

量及品质提供基础服务。



烟叶作为烟草栽培的目的产品 , 其颜色、 光泽、 油分、 香 气等烟叶品质指标, 受烟叶生长过程、 特别是成熟期生 理生化反应进行的状况的影响, 这与烟叶内保护酶的 清除效应有着直接的联系 , 而超氧化物歧化酶( su peroxide dismutase, SOD, EC1 15 1 1) 是酶促清除系统 的重要组成部分 SOD
[ 5] [ 4] [2 - 3]

1
1 1

试验部分
试验仪器 紫外 - 可见分光光度计( UV - 7504PC, 中国上海欣茂

仪器有 限公司 ) ; 电 子天 * ( LIBROR AEG - 220, 感 量: 0 0001 g, 日 本 岛 津公 司 ) ; 水 纯 化 系 统 ( Human Nex Power 2000 型, 韩国 Human 公司 ) ; 台式高速冷冻离心 机( Allegra X - 22R, Beckman Coulter 有限公 司) ; 等离子 体发射光谱仪 ( UPT IMA 5300V, Perkin Elmer, USA) ; 移 液枪( 250 uL、 1000 uL, 上海求精生化试剂仪器有限公 司) 等。所用试剂皆为国产分析纯。 1 2 试验材料和方法 供试材料为云烟 87 成熟叶, 由贵州省烟草科学 研究所提供。 1 2 2 酶液的制备 将新鲜的烟叶 416 7573 g 冷冻后搅碎匀浆 , 用 50 mmol/ L 的磷酸盐缓冲液 840 mL ( pH= 7 6) 在 4 下浸 泡 20 h, 4 层 纱 布 过滤 ; 滤液 在 10000 r/ min 下冷 冻 ( 4 ) 离心 8 min, 得上清液; 在上清液中加入 55% 饱 和度的硫酸铵, 在 4 下冷藏 20 h, 离心分离 ; 沉淀用 50 mmol/ L 磷酸盐缓冲液 150 mL( pH= 7 6, 4 ) 溶解, 加入 0 25 倍的冷冻乙醇和 0 15 倍的冷 冻氯仿, 冷藏 2 h, 离心分离( 10500 r/ min, 20 min) , 取上清液 , 加入 3 倍的冷冻丙酮, 冷藏 2 h, 用直径为 0 45 m 的滤膜抽 滤后, 沉 淀用 10 mmol/ L ( pH = 7 6) 的磷酸缓 冲液溶 解, 用聚乙二醇 20000 透析浓缩至 20 mL, 得酶液。 1 2 3 SOD 活性测定方法 SOD 活性采用氮蓝四唑法 ( NBT) [ 11] 测定 : 原理是 通过 SOD 抑制氮蓝四唑 ( NBT ) 在光下的还原作用来确 定酶活性大小。在有氧化物质存在下, 核黄素可被光 还原 , 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产 1 2 1 试验材料

。 SOD 根据其辅基部位结合金属离 Zn -SOD、 Mn - SOD 和 Fe -

子的 不 同, 可 以 分 为: Cu

等。SOD 通过催化超氧阴离子自由基发生歧化

反应 , 生成 H 2O2 和 O2 , H2 O2 在过 氧化 氢酶 ( catalase, CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH - Px) 催化下转化为 水而得以清除, 达到清除 O2 的效果
[ 6]

, 所以 SOD 在清

除超氧阴离子自由基方面起着至关重要的作用 , 具有 防御活性氧毒性、 增强机体抗辐射损伤能力、 防衰老等 功效。 作为地貌发育极具特色的我国西南喀斯特区喀斯 特山区 , 是中国重金属矿的主要所在地之一。在快 速工业化过程中 , 重金属污染给当地环境保护造成一 定压力
[ 8] [ 7]

。已有研究表明 : 云南金顶超大型矿区长期
[ 9]

矿业活动对矿区水系沉积物造成了严重的镉污染



重金属污染物排放所造成的土壤和水系重金属污染, 影响了包括烟草在内的植物的生长、 发育, 给农业生产 造成巨大损失, 进而对人类健康构成了巨大威胁。重 金属对植物 SOD 的影响 , 国内外已有不少研究
[ 10]

,但

多集中在重金属离子被植物吸收、 富集后对植物中某 一部位的 SOD 活性产生影响方面, 而利用重金属离子 对纯化的烟叶 Cu Zn - SOD 活性影响的研究却鲜有报 道。本 文 拟 以 贵 州 烟 叶 为 研 究 材 料, 探 讨 Fe 2+ 、 Mn 、 Se 、 Sb 、 Cd 对初步纯化的 Cu Zn - SOD 活 性影响的规律 , 为 SOD 的抗氧化性研究提供一定的理 论依据, 同时也能为土壤污染的酶指标体系的建立提 供一定的数据参考, 进而为提高中国西南地区烟草产
2+ 2+ 2+ 2+

邓家军等

重金属离 子对烤烟叶片中铜锌超氧化物歧化酶活性的影响

3 Cu Zn -SOD 的鉴定

生超氧阴离子自由基, 超氧阴离子自由基可将氮蓝四 唑还原为蓝色的甲腙 , 甲腙在 560 nm 处有最大吸收。 而 SOD 可清除超氧阴离子自由基, 从而抑制了甲腙的 形成。于是光还原反应后 , 反应液蓝色愈深, 说明酶活 性愈低 , 反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大 小。在总体积为 3 mL 的反应液中含有 1 5 mL 浓度为 50 mmol/ L 的磷酸 缓冲液 ( pH = 7 8) ; 0 3 mL 浓 度为 130 mmol/ L 的甲硫氨酸 ; 0 3 mL 浓度为 750 mol/ L 的 NBT ; 0 3 mL 浓度为 100 mol/ L 的 EDTA - Na2 ; 0 3 mL 浓度为 20 mol/ L 的核黄素 ; 0 05 mL 酶与金属的混合 液( 两支对照管以 50 mmol/ L, pH = 7 8 的磷酸缓冲液 代替酶与金属的混合液 ) ; 0 25 mL 蒸馏水。混匀后将 1 支对照管置于暗处 , 其它各管于 4000 lx 光下照射 20 min。至反应结束后 , 以不照光的对照管做空白, 在 560 nm 处分别测定其它各管的吸光度。已知 SOD 活性单 位以抑制 NBT 光化 还原的 50% 为 1 个酶 活力 单位 ( U) , SOD 活性用比活力表示 , 其意义为每克酶制剂所 具有的酶活力单位数 ( 单位为 U / g ) 。可以按下式计 算 SOD 比活力 = ( Ack - A E) V/ ( A ck 05 W Vt ) 式中 A ck : 照光对照管的吸光度, AE : 样品管的吸 光度, V: 样品液总体积 ( mL) , V t: 测定时的酶液用量 ( mL) , W: 样鲜质量( g) 。 1 2 3 重金属对 Cu Zn - SOD 活性的影响 将酶液稀释 10 倍后 , 分别与 10 mg/ L、 20 mg/ L、 30 2+ 2+ 2+ 2+ mg/ L 、 50 mg/ L、 100 mg/ L 的 Fe 、 Mn 、 Se 、 Cd 及 10 mg/ L、 20 mg/ L、 30 mg/ L 、 50 mg/ L、 80 mg/ L 的 Sb2+ 以 1: 9 的比例混合 , 30 min 后 , 取 0 05 mL 的酶与金属 的混合液于测定酶活性的反应液中测定酶的活性 ( 计 算 SOD 比活力时, Vt = 0 05 比例 ) 。 实际加入的酶液所占的

2 2

2 2 1 酶活性对 H 2O2 和乙醇 - 氯仿的敏感性 本试验将硫酸铵盐析分级分离、 乙醇 - 氯仿沉淀除 杂、 丙酮再沉淀分级得到 的酶液进行酶的类 型鉴定。 由于 Cu Zn -SOD 对 H 2O2 敏感而对氯仿 - 乙醇不敏感, Mn -SOD 对 H 2O2 不 敏感 而对 氯仿 - 乙 醇敏感 , 而 Fe SOD 对 H 2O2 和氯仿 - 乙醇均敏感 , 因此可用这两种抑 制剂鉴定烟叶 SOD 的类型。
表 1 H 2O2 对酶活性的影响 H 2O2 浓度 / ( mmol/ L) 0 1 2 3 4 5 酶活性 / ( U/ g ) 16 968 2 354 -0 585 0 665 1 847 1 933 表 2 乙醇 - 氯仿对酶活性的影响 乙醇 - 氯仿浓度 / ( mmol/ L) 0 0 5 1 1 5 2 2 5 酶活性 / ( U/ g) 16 968 15 479 14 654 14 132 14 015 13 766 酶活性抑制率 0 8 78% 13 64% 16 71% 17 40% 18 87% 酶活性抑制率 0 86 13% 103 45% 96 08% 89 11% 88 61%

由表 1 可知: 1 mmol/ L 的 H 2O2 对酶活性的抑制 率为 86 13% , 2 mmol/ L 的 H 2O2 几乎使酶失活。而由 表 2 可知 : 1 mmol/ L 的 乙醇 - 氯仿对酶活性的抑制率 为 13 64% , 2 mmol/ L 的乙醇 - 氯仿对酶活性的抑制率 为 17 40% 。所以该酶对 H 2O2 敏感, 而对乙醇 - 氯仿较 不敏感, 可以初步判定该酶为 Cu Zn - SOD。 2 2 2 酶液中金属元素含量的测定 本试验通过 ICP -AES 测定了样品中金属元素 Ni、 Cu 、 Zn、 Fe 、 Mn 的含量 , 试验结果见表 3。
表 3 酶液中几种重金属 ( Ni、 Cu、 Zn、 Fe and Mn) 的含量 分析元素 Ni Cu Zn Fe Mn 分 析波长/ nm 232 0 324 8 213 9 248 3 279 5 *均浓度 / ( mg/ L) 未检出 0 652 1 216 未检出 未检出

2
2 1

结果与讨论
酶液制备

本试验通过 ( NH4 ) 2 SO4 盐析沉淀实现分 级分离, 饱和度达 55% 以上 , 活力回收率不再增加 , 超过 60% 时沉淀溶解液的颜色迅速变深且活力回收率下降。试 验确定( NH 4) 2 SO4 的饱和度为 55% ~ 60% , 这样既保证 了最大活力回收率又避免了过多杂质的 引入
[ 12]

。使

用 0 25 倍体积的乙醇和 0 15 倍体积的氯仿混合液去 除 Fe - SOD、 Mn - SOD 和部分其他杂蛋白, 再通过丙酮沉 淀继续去杂脱色。

由以 上结果综合分 析, 得出 样品中只 含有 Cu Zn -SOD, 无 Mn - SOD, Fe -SOD 和 Ni SOD。

4 2 3 重金属离子对 Cu
2+ 2+

中国烟草学报

2010 年 6 月 第 16 卷 第 3 期

Zn - SOD 活性的影响

mg/ L时, 酶活性分别比对照降低了 37 74% 、 44 58% ; 而当 Mn2+ 浓度提高到 30 mg/ L 时 , 酶活性开始大幅度 上升 ; 当浓度提高到 50 mg/ L 时 , 酶活性大约是对照的 1 07 倍; 当浓度达到 100 mg/ L 时 , 酶活性继续上升 , 只 是幅度较 小。所 以随着 Mn2+ 浓 度的提 高, Cu
2+

2 3 1 Fe 、 Se 对 Cu Zn - SOD 活性的影响 Fe2+ 、 Se2+ 对 Cu Zn - SOD 活性的影响见图 1。

Zn -

SOD 的活性呈现先降低后升高的趋势, 这与文献上报 导的对植物活体施以 Mn 胁迫的研究结果是一致的。 鲍思伟 [ 16] 在研究叶面施锰对豌豆生物效应的影响时 发现: 喷施不同浓度硫酸锰溶液 , 能增强豌豆叶片的 SOD 活性 , 降低活性氧生成速率。其它文献 相似的报道。
[ 17 -18]

也有

第二 , 当反应液中的 Sb2+ 浓度为 10 mg/ L 时, 酶活
图1 Fe2+ 、 Se2+ 对 Cu Zn - SOD 活性的影响

性比对照 降低 了 22 56% , 而 当 Sb2+ 浓 度提 高到 20 mg/ L 时 , 酶活性开始升高 , 当浓度提高到 30 mg/ L 时, 酶活性接*对照值, 以后随着 Sb2+ 浓度升高, Cu Zn SOD 的活性变化幅度不大。所以随着 Sb2+ 浓度的提 高, 酶活性呈现先降低后升高的趋势, 但酶活性的整体 变化幅度不大。 第三, Cd2+ 浓度在 0~ 100 mg/ L 范围内 , Cu SOD 的活性对 Cd
2+ 2+

当 Fe2+ 的浓度为 10 mg/ L 时酶活 性的下降率为 64 85% , 随着 Fe 浓度增加, 酶的活性逐渐增大 , 当浓 度为 100 mg/ L 时, 酶的活性是 Fe2+ 浓度为零时的酶活 性的 1 17 倍。这与文献上报道的运用活体研究的结 果基本一致。章艺等[ 13] 在研究高铁胁迫对大豆叶片 体内保护系统及膜脂过氧化的影响时发现: 浙春 3 号 在 100 mg/ kg 的铁胁迫下, SOD 的活性达到最大, 尔后 随铁浓度的升高而下降。蔡妙珍等[ 14] 研究表明 : 过 量 Fe 胁迫明显抑制了叶片 SOD 的活性 , 使活性氧 清除能力减弱。对于 Se 2+ 来说 , 酶的活性对 Se2+ 很敏 感, 当 Se 浓度 为 10 mg/ L 时, 酶 活 性的 降 低率 为 58 78% , 当浓度增大到 20 mg/ L 时, 酶活性几乎为零。 由此可见 , Se 能够抑制 Cu Zn -SOD 活性。该结果与 [ 15] 文献 报道的利用植物活体研究的结果基本一致。 2 3 2 Mn 、 Sb 和 Cd 对 Cu Zn -SOD 活性的影响 2+ 2+ 2+ Mn 、 Sb 和 Cd 对 Cu Zn -SOD 活性的影响见 图 2。
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+

Zn -

比较敏感 ; 当浓度为 10 mg/ L 时 , 酶

几乎完全失活。随着 Cd 浓度的不断升高, 酶的活性 大幅度攀升, 与 20 mg/ L 浓度下的酶活性相比, 在浓度 为 30 mg/ L、 50 mg/ L、 100 mg/ L 时的酶活性分别提高了 1 46 倍、 2 55 倍和 8 42 倍。所以, 随着 Cd2+ 浓度的增 大, Cu Zn - SOD 的活性呈现大幅度降低后 , 再大幅度 升高 的趋 势。黄 玉 山等 [ 19] 对 紫 羊茅 ( Festuca rubra L. ) 2 个品种的研 究也表明: 随着 Cd2+ 浓度的提高, SOD 活性呈现先升高后降低的趋势。强维亚等 在 研究镉和增强紫外线 - B 辐射复合作用对大豆生长的 影响时发现: Cd 可导致 SOD 和过氧化物酶 ( POD) 活性 升高, 在 Cd 作用下 , SOD 活性升高较 POD 更为显著。 另有研究结果 与此类似。 2 3 3 重金属浓度与相应的 Cu 分析 本研究运用 SPSS 11 5 软件对重金属浓度与相应 的 Cu Zn - SOD 活性相关性进行了分析 , 其结果如表 4。表 4 中的数据说明: 重金属离子浓度与相应的酶 活性之间相关性系数越大 , 表示它们之间越接*线性 关系, 如果是负值 , 则呈负线性关系; 受重金属离子影 响的酶活性之间的相关性系数值越大, 表示受这两种 重金属离子影响的酶活性的变化规律越趋*一致, 如
[ 21 -22] [ 20]

Zn -SOD 活性相关性

图 2 Mn 、 Sb 和 Cd

2+

2+

2+

对 Cu

Zn - SOD 活 性的影响

果是负值 , 则变化关系则趋于相反。 已有研究表明[ 23] : 每个 Cu Zn -SOD 分子含 1 个 Cu 离子和 1 个 Zn 离子, 分子为二聚体 , 不含色氨酸,

第一 , 当 反 应液 中 的 Mn2+ 浓 度 为 10 mg/ L、 20

邓家军等

重金属离 子对烤烟叶片中铜锌超氧化物歧化酶活性的影响

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酪氨酸含量亦少 , 构象分析结果表明 Cu, Zn - SOD 含 螺旋很少( 3% ~ 8% ) , 主要是 - 折叠 ( 45% ) ; 亚基由 8 股逆向*行肽链的 - 折叠构成一桶状结构, 十分稳定。 Cu Zn - SOD 活性中心形状像一个椭圆形口袋( 15, 9, 6 ) , 在其附*形成一个明显的正电势梯度, 口袋底部 金属辅基 Cu 与 4 个 His 和 1 个 H 2O 配位 , Zn 与 3 个 His 和 1 个 Asp 配位, Cu 与 Zn 之间通过共同连接 1 个 His 而形成咪唑桥结构。Zn 的作用一是可调节咪唑基
表 4 重金属浓 度与 Cu Pearson 相关性 重金属离子浓度 酶活性 ( Fe) 酶活性 ( Mn) 酶活性 ( Se) 酶活性 ( Sb) 酶活性 ( Cd) 重金属离子浓度 1 0 604 0 542 - 0 981 * 0 371 0 141
*

与 Cu 的相互作用 , 二是对活性中心结构起稳定作用。 超氧阴离子在 H + 存在的情况下, 经 SOD 催化 , 生成 O2 和 H 2O2 。关于 Cu 提出的理论如下 : Zn -SOD 的催化机理, Boden 等[ 24]

Zn - SOD 活性之间及 Cu 酶活性 ( Mn)

Zn -SOD 活性之间的相关性 酶活性 ( Se) 酶活性 ( Sb) 酶活性 ( Cd)

酶活性 ( Fe) 1 0 801 -0 542 0 943 0 634
* *

1 -0 439 0 774 0 644

1 - 0 337 0 029 1 0 561 1

注 : * * 表示在 0 01( 双尾检测) 水*上相关性显著。

O2

作 为一 种诱 导酶 , Cu Zn - SOD 活 性 受其 底物 浓度的诱 导。由于 逆境胁迫 下 O2 的产生 会增
Zn - SOD 活性的增强。但当 O2 的

氨基酸作用产生配合物 , 使部分酶的空间结构发生变 化而失去活性。荧光猝灭的动力学分析表明重金属与 酶形成的配合物由两个独立步骤完成 : 第一步是双分 子快速缔合过程 , 形成了结构疏松的配合物, 第二步是 单分子慢速过程 , 即松散的配合物 异构化 成为结合 紧密的配合物。同时 , 使用红外光谱 ( FTIR 谱 ) 和圆偏 光二向色性谱( CD 谱 ) 证实相互作用过程伴随了蛋白 质二级结构的变化( 主要是 - 螺旋和 - 折叠 ) [ 29] 。 第二 , 有些重金属离子( 如 Fe2+ 、 Mn2+ ) , 因其金属 特征与 Cu Zn -SOD 活性中心的 Cu2+ 、 Zn2+ 的金属特 征相似, 能够进入活性中心以取代因透析等原因而丢 失的部分 Cu2+ 、 Zn2+ , 使得部分因无中心离子而丧失 的酶活性的 Cu Zn - SOD 重新恢复活性[ 30] 。 第三, 由于 Cu 的胁迫下 ,
O2

多, 从而诱导了 Cu

增加远远超过正常的歧化能力时, 细胞内多种功能受 到破坏 , 生理代谢紊乱 , SOD 活性反而受 到抑制而下 降[ 25] 。 植物体受到 重金属 ( Fe、 Mn、 Se 、 Sb 、 Cd 等 ) 胁迫 后, 可以 引起 植物 细胞 超微结 构变 化[ 26] , 抑制 酶活 性[ 27] , 诱导产生大量的 O2 , O2 能损伤主要的生物大 分子 ( 如蛋白质和 DNA) 及引起膜脂过氧化 [ 28] , 而植 物中的多种抗氧化防卫系统能够清除 O2 , 保护细胞 免受氧化胁迫的伤害, 这也是植物忍耐重金属胁迫的 主要机理之一。重金属胁迫能诱导 Ubiquitin、 热休克 蛋白( HSP) 、 DnaJ - like 蛋白、 几丁质酶、 - 1, 3 葡聚糖 酶、 富含脯氨酸细胞壁蛋白 ( PRP) 、 富含甘氨酸细胞壁 蛋白 ( GRP) 和病原相关蛋白 ( PR) 等基因的表达。这些 胁迫蛋白基因能响应多种重金属胁迫而表达 , 在重金 属胁迫下 , 这些胁迫蛋白质协同作用可能在清除重金 属变性蛋白质、 维持细胞的正常代谢和提高细胞的重 金属抗性方面有重要作用 。 在本 研 究 中, 加 入 低 浓 度 的 外 源 Fe2+ 、 Mn2+ 、 Se 2+ 、 Sb2+ 、 Cd2+ , 都能使 Cu Zn - SOD 活 性产生不同 程度的降低。随着加入的外源重金属离子浓度的不断 增大 , 所引起的 Cu Zn -SOD 活性变化趋势不同 , 其原 因可能是由以下 3 种机制造成的 : 第一 , 重金属离子具有空轨道, 容易和酶蛋白的
[ 25]

Zn - SOD 是诱导酶 , 在重金属离子
[ 31]

的产生会增多

, 从而诱导了 Cu

Zn -

SOD 活性的增强。但过多的

O2
2+

又会抑制酶活性。

总之, 外源重金属离子 Fe 、 Mn2+ 、 Se 2+ 等直接作 用于离体的酶时 , 可能通过以上 3 种机制对酶的活性 产生影响。当酶活 性提高的程度与降低 的程度相等 时, 所表现出来的酶的总活性为零 ; 当酶活性提高的程 度逐渐大于降低的程度时 , 所表现出来的酶的总活性 逐渐提高 ; 当酶活性提高的程度逐渐小于降低的程度 时, 所表现出来的酶的总活性逐渐降低。而在重金属 离子胁迫下的植物体 , SOD 酶活性发生变化可能是因 为进入植物体的重金属离子参与了氧化还原循环 [ 32] , 引起活性氧的变化, 在一定浓度范围内 , 活性氧作为信

6 号分子 [ 33] , 可能促进 SOD 酶活性。但随着 Fe2+ 、 Mn2+ 等离子浓度的增大, 当活性氧浓度达到一定临界值时, 抑制了 SOD 酶活性 [ 34] 。
[ 15] [ 16] [ 17] [ 18] [ 14]

中国烟草学报

2010 年 6 月 第 16 卷 第 3 期

3

结论
硫酸铵盐析分级分离、 乙醇 - 氯仿沉淀除杂、 丙酮 Zn - SOD 的酶液。在浓
2+

再沉淀分级, 得到主要含 Cu

度为 0~ 100 mg/ L 范围内 , 低浓度的重金属离子 Fe 、 Mn2+ 、 Se2+ 、 Sb2+ 、 Cd2+ 都能使 Cu Zn - SOD 活性降低。 随着重金属离子浓度的提高, 不同种重金属离子使 Cu Zn - SOD 活性变化趋势不同 : Se2+ 能使酶活性急剧降 低, 而 Fe2+ 、 Mn2+ 、 Sb2+ 、 Cd2+ 能 使酶活性 逐渐 升高。 就敏感性而言, Cu Zn - SOD 对 Mn 、 Se 2+ 2+ 2+ Fe 、 Cd 次之 , 而对 Sb 最不敏感。 参考文献
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